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詳解細(xì)胞因子試劑盒的五種檢測方法
2019-07-18 瀏覽次數(shù)：2745
細(xì)胞因子試劑盒主要用于科研方面，不用于臨床診斷，可以用于檢測各種指標(biāo)。做快速檢測時，待檢測的樣品數(shù)越多，出現(xiàn)加錯的概率也就越大，特別容易出錯的是在酶聯(lián)偶合物（conjugate）與樣品液或標(biāo)液混合的階段，因?yàn)檫@時使用的是單道槍。其實(shí)解決的方法比較簡單，我們只要把操作上的順序加以調(diào)換，即先把待測液或標(biāo)液加入稀釋孔中，再加入酶聯(lián)偶合物就不會出現(xiàn)錯誤了。而且這兩個順序交還對結(jié)果也沒有影響，因?yàn)檫@一步的主要目的是讓兩種液體充分混合。
接下來就來介紹下細(xì)胞因子試劑盒的五個檢測方法：
一、間接法：使用了二抗增加信號強(qiáng)度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。間接法只能用于測定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。
二、捕獲法：全稱捕獲包被法也稱為反向間接法，主要用于測定血清中某類抗體亞型如IgM。為排除血清中IgG的干擾，用抗IgM抗體包被后用于捕捉樣本中的IgM，然后加入特異性結(jié)合抗原進(jìn)行后續(xù)檢測。捕獲包被法常用于對病毒性感染的早期診斷。在測定IgM的實(shí)驗(yàn)中常受到類風(fēng)濕因子（RF，一種能結(jié)合多種動物IgG Fc的自身IgM抗體）的干擾，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段制備酶標(biāo)抗體可以消除RF的干擾，這一方法在雙抗體夾心法中也具有同樣的效用。
三、競爭法：是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競爭性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體（或抗原）濃度越高，則能與固定抗原（或抗體）結(jié)合的酶標(biāo)抗體（或抗原）就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對照相比，顯色越淺，表示檢測樣本中抗體（或抗原）含量越高。該法特別適合小分子物質(zhì)的檢測也可用于檢測比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗原常用于檢測小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個以上的識別位點(diǎn)，不適用于雙抗夾心法進(jìn)行測定。該方法在商業(yè)化ELISA試劑盒中被廣泛運(yùn)用。競爭法測抗體常常用于檢測某些干擾物質(zhì)不易去除的樣本及難以純化得到抗原等情況。下圖以固相酶標(biāo)抗原為例，固相酶標(biāo)抗體類似。其實(shí)競爭法在實(shí)際運(yùn)用中有很多的花樣和變種，以后我們再一一細(xì)說。
四、直接法：僅需要抗原和酶標(biāo)一抗，操作簡便，可避免交叉反應(yīng)，然而該方法要求酶標(biāo)一抗有較高的特異性要求，同時也并非所有的一抗適合標(biāo)記處理。直接法在實(shí)際運(yùn)用中并不多見，它并不能對樣本中抗體進(jìn)行定量分析，因?yàn)闃颖局锌贵w是非酶標(biāo)抗體，無法進(jìn)行后續(xù)顯色，但是該法經(jīng)過改進(jìn)就是競爭法。
五、夾心法：分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法，雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢，但該法只適用于有多個結(jié)合位點(diǎn)的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關(guān)的，以及在科研中檢測細(xì)胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時會將樣本和酶標(biāo)抗體同時加入進(jìn)行反應(yīng)，稱為雙抗體夾心一步法，因?yàn)椴僮鲿r間短，在商業(yè)化生產(chǎn)中有很大優(yōu)勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應(yīng)（hook ffect），因?yàn)榇藭r如果樣本中抗原含量過高會導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而無法形成“夾心復(fù)合物”，此時測出的結(jié)果將低于實(shí)際含量甚至是陰性結(jié)果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進(jìn)行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進(jìn)行測定，故此靈敏度相對而言高于我們隨后要說的間接法。
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